合佑生生物|RCL检测平台新选择

质量为先 创新为本

复制型病毒与产品的安全性相关，需参考相关研究经验或文献，研究并建立灵敏的检测方法。常见的检测方法包括指示细胞培养法、直接qPCR法等。待测样品包括病毒载体制备过程中收获的病毒上清、EOPC（病毒生产终末细胞），细胞治疗终产品和临床病人样本。根据目前的研究技术水平，建议采用指示细胞培养法对慢病毒载体进行RCL检测。对于HIV衍生的慢病毒载体，其RCL检测所用阳性对照可考虑使用满足检测要求的HIV病毒，如缺乏辅助基因的，同制备方法，并在符合要求的环境中妥善操作和使用。RCL检测指标方面，通常认为p24蛋白、逆转录酶活性、psi- gag和VSV-G序列等的检出可反映RCL的存在，结合病毒载体具体情况和研究情况，选择合适的检测指标。

一、RCL检测简介

CAR-T制备中，大多数应用于细胞基因治疗的逆转录病毒和慢病毒均被设计为复制缺陷型病毒载体，并采用多个质粒进行共转染以表达慢病毒或者γ-逆转录病毒。在生产中可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组，导致产生复制型病毒，对人体造成严重的威胁，故RCL检测是安全性检测中非常重要的项目之一。

FDA推荐的RCL检测方法是利用敏感细胞对病毒载体中可能存在的RCL进行培养扩增，并在培养终点进行检测。

扩增期：将待测物与对HIV-1易感并且可大量扩增病毒的细胞系( 通常用 C8166) 孵育，细胞传代5次以上，培养至少3周。

RCL扩增期培养

指示期：3 周后收集培养上清，接种于C8166 细胞中培养 7d 后检测RCL 标志物。

RCL指示期培养

RCL标准化操作流程

检测方法：

A：P24 ELISA 的方法：适用于由载体制备过程中病毒基因组之间的重组形成 RCL 的检测。

B：Psi-gag基因检测：使用了对保守序列的PCR扩增，并通过凝胶电泳成像来判断样品中是否含有阳性对照能够跑出的目的条带。

C：qPCR方法：采用实时定量 PCR 方法( Q-PCR) 测定假型病毒 VSV-G 复制过程中的 VSV-G 基因序列。

二、RCL检测方法分析

美国FDA 2020年发布的关于RCR/RCL检测指南提出：对于RCR/RCL的检测包含指示细胞培养法、ELISA法(p24蛋白测定)、PCR/Q-PCR法（通过psi-gag或VSV-G聚合酶链反应）、PERT法（产物增强性逆转录检测法）共4种检测方法。

复制型慢病毒RCL的指示细胞培养法检测需28天，耗时较长；而基于VSV-G序列的Q-PCR方法和基于gag序列的PCR方法具有检测时间短、灵敏度高、可重复性强等优点。目前，许多CAR-T申报企业采用Q-PCR/PCR方法直接测定终产品中的VSV-G序列或psi-gag序列，作为快速放行方法。

上海合佑生生物科技有限公司结合市场需求和技术平台优势，在ELISA法（p24蛋白测定）、Psi-gag序列区域的PCR法或VSV-G聚合酶链反应法等方法积累开发经验。欢迎广大客户垂询。全国免费咨询电话：021-36696819。

欲知合佑生生物更多RCL检测服务详情，也可咨询商务总负责人谢先生：15201775322 。

RCL不同检测方法概述

1、ELISA 法( p24 蛋白测定)

通过预先包被HIV-1核心抗体的96孔板在底物TMB以及过氧化根的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。

b)定量分析、灵敏度高

使用标准品绘制标准曲线， 计算样品中的p24蛋白浓度以及进行RCL检测。P24 ELISA 法灵敏度可达到3pg/ml。

c)适合多种样本

P24检测可检测终末细胞、浓缩载体、血清血浆等多种样本。本平台具有严格的Cut off判断标准，以保证试验结果的准确性、有效性和可重复性。

2、Psi-gag序列区域的PCR法

3、VSV-G检测

 在人们不断改进病毒载体的过程中，利用水疱性口炎病毒G蛋白（VSV—G）替代HIV-1的env基因可以有效的降低RCL的风险。因此通过VSV-G基因的特定病毒核酸序列的检测可以有效判断是否发生同源或非同源的病毒重组。

三、RCL检测平台优势

P3实验室是防护实验室，适用于处理对人体、动植物或环境具有高度危害性，通过直接接触或气溶胶使人传染上严重疾病甚至致命的病毒，如SARS、H7N9、MERS等。因操作使用成本高，维护难度系数大，RCL检测主要还是依赖于国外CRO/CDMO企业，检测成本高，流程也颇周折，给客户研发带来不小的阻力。现合佑生生物可为客户提供国内RCL检测，助推您的药物研发进程。

P3实验室图片

拥有声光报警、压力表、无接触对讲、生物安全柜、排风机组以及完整的废水处理系统的P3生物安全实验室可以安全高效的进行RCL检测。

HIV-1真毒对照

1、P24、 psi-gag、 VSV-G检测法联用。

2、结合病毒载体实际情况，选择合适检测指标，避免假阳性。

3、在P3生物安全实验室进行RCL检测，安全、高效。

4、HIV-1真毒作阳性对照，保证试验结果的可靠性。

上海合佑生生物科技有限公司团队深耕细胞治疗领域多年，持续完善质量管理体系，更新优化技术服务平台，团队将继续秉承创新、开放、包容的企业文化和态度，基于临床需求、行业痛点，推陈出新，给客户提供真正有价值差异化的产品和服务。希望在大家共同的加持下夯实相关研发产品和服务管线，进一步赋能领域合作伙伴，共同推动细胞治疗领域发展。

上海合佑生生物科技有限公司团队深耕细胞治疗与基因治疗多年，是一家提供该领域产品和服务为主的创新型生物科技公司。公司核心业务为人源免疫细胞采集、应用服务以及配套的生物试剂。公司坚持以人才为基础，质量为先，创新为本的核心价值观，以技术创新为出发点，不断提高临床生物样本采集、制备、应用的质量，引领国产替代的行业新标准，为中国创新药发展和超越提供坚实的基础。